1000 холодильник

МЕТОДИЧЕСКИЕ УКАЗАНИЯ МЕТОДИЧЕСКИЕ УКАЗАНИЯ для выявления антител к вирусу инфекционного бронхита кур иммуноферментным анализом 1. ОБЩИЕ ПОЛОЖЕНИЯ 2. ПОРЯДОК ПРИМЕНЕНИЯ 3. ПОДГОТОВКА КОНПОНЕНТОВ НАБОРА И ОБОРУДОВАНИЯ ДЛЯ ПРОВЕДЕНИЯ ИССЛЕДОВАНИЙ 4. ПРОВЕДЕНИЕ ИММНУНОФЕРМЕНТНОГО АНАЛИЗА 5. УЧЕТ РЕЗУЛЬТАТОВ РЕАКЦИИ 6. ОЦЕНКА РЕЗУЛЬТАТОВ РЕАКЦИИ МИНИСТЕРСТВО СЕЛЬСКОГО ХОЗЯЙСТВА УТВЕРЖДАЮ РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ Зам.начальника Департамента ветеринарии ГЛАВНОЕ УПРАВЛЕНИЕ ВЕТЕРИНАРИИ n 13-7-2/1222 27 апреля 1998 г. МЕТОДИЧЕСКИЕ УКАЗАНИЯ для выявления антител к виру- су инфекционного бронхита кур иммуноферментным анализом 1. ОБЩИЕ ПОЛОЖЕНИЯ 1.1. Специфические антитела к вирусу инфекционного бронхита кур (ИБК) выявляют в сыворотках крови с помощью набора компонентов иммуноферментным анализом (ИФА). Для ретроспективной диагностики болезни у невакцинированного птицепоголовья и контроля напряженности поствакцинального иммунитета. 1.2. В состав набора входят: - Компонент n1 (К1) - положительная сыворотка крови кур к вирусу ИБК (положительный контроль), разведенная 1:100, лиофилизированная, 1,0 смЗ - 1 ампула (флакон); - Компонент n2 (К2) - отрицательная сыворотка крови кур (отрицательный контроль), не содержащая антител к вирусу ИБК, разведенная 1:100, лиофилизированная, 1,0 см3 - 1 ампула (флакон); - Компонент n3 (К3) - очищенный антиген вируса ИБК, адсорбированный по о,1 см3 в лунках планшета для ИФА-2 планшета; - Компонент n4 (К4) - антивидовой иммунопироксидазный коньюгат против иммуноглобулинов кур, лиофилизированный, 0,2 или 0,5 смЗ - 1 ампула (флакон); - Компонент n5 (К5.1,; К5.2.; К5.3.) - набор солей для приготовления буферного раствора; хлорид натрия (nacl) - 8,76 г - 1 флакон; натрий фосфорнокислый двузамешенный (nа2 hpo4 х 12 h2 o) - 3, 58 г - 1 флакон; калий фосфорнокислый однозамешенный (КН2 РО4) - 1,36 г - 1 флакон. Каждая соль фасуется в отдельный флакон. - Компонент n6 (К6) - детергент твин-20 или тритон Х-100, 0,5 см3 - 1 пробирка, - компонент n7 (К7) - 5-аминосалициловая кислота, порошок, по 20 мг - 2 пробирки; - Компонент n8 (К8) - гидроперит - 0,5 г таблетка в упаковке - 1 шт. 1.3. По внешнему виду положительная 1000 холодильник отрицательная сыворотки крови кур представляют собой сухую гомогенную пористую массу белого цвета, расфасованы в ампулы (флаконы) под вакуумом или под инертным газом - азотом. 1.4. На ампулы или флаконы с иммуноспецифическими компонентами наклеивают этикетки с указанием наименования препарата, объема в ампуле, флаконе или пробирке в см3, рабочего разведения, номера серии, номера контроля, срока годности. На флаконы, пробирки для микропроб с неспецифическими компонентами наклеивают этикетки, на которых указывают наименование компонентов, их количество в см3 или мг. 1.5. Ампулы 1000 холодильник флаконы упаковывают в картонные коробки с наличием гнезд или перегородок, обеспечивающих неподвижность ампул 1000 холодильник целостность препарата. На каждую коробку с набором наклеивают этикетку, на которой указывают наименование предприятия-изготовителя 1000 холодильник его товарный знак, полное название набора, номер серии, номер контроля, название 1000 холодильник количество ампул (флаконов, пробирок) каждого компонента, входящего в набор, объем компонента в одной ампуле (флаконе, пробирке), дату изготовления (месяц, год), срок годности, условия хранения 1000 холодильник обозначение ТУ. 2. ПОРЯДОК ПРИМЕНЕНИЯ 2.1. Для исследования в лабораторию доставляют сыворотку крови кур от 20-25 голов (по 0,2-0,3 см3) из птицехозяйств, где имеется подозрение на данное заболевание. Рекомендуется проводить доставку парных проб сыворотки крови, взятой в начале заболевания 1000 холодильник повторно через 10-14 дней. Отобранные пробы хранят в морозильной камере бытового холодильника 1000 холодильник доставляют одновременно. 2.2. Для определения напряженности поствакцинального иммунитета в лабораторию доставляют сыворотки крови от вакцинированного птицепоголовья спустя 3-4 недели после применения вакцины против инфекционного бронхита кур. 3. ПОДГОТОВКА КОНПОНЕНТОВ НАБОРА И ОБОРУДОВАНИЯ ДЛЯ ПРОВЕДЕНИЯ ИССЛЕДОВАНИЙ 3.1. Для постановки ИФА используют одно- 1000 холодильник восьмиканальные автоматические пипетки со сменными наконечниками разных объемов, термостат с температурой нагрева 37+-0,5С, бытовой холодильник, ph-метр (тип 121 или 340), промывающее устройтво ручное или полуавтоматическое, спектрофотометр с вертикальным лучом или полный комплект оборудования для ИФА. 3.2. Перед приготовлением рабочих растворов набор с компонентами выдерживают 30 мин при комнатной температуре (18-20°С). Приготовление растворов 3.3. Раствор n1 - 0,01 М фосфатно-буферный раствор с 0,15 М хлоридом натрия ph 7,2-7,4 1000 холодильник твином-20 или тритоном Х-100 до конечной концентрации 0,05%. Для его приготовления из набора берут флакон с компонентом 5,1 (хлорид натрия), содержимое которого вносят в мерную колбу на 1000 см3, растворяют дистиллированной водой 1000 холодильник доводят объем до метки, получая 0,15 М раствор хлорида натрия. Затем отдельно на физиологическом растворе (о,85%-ный раствор хлорида натрия) готовят растворы "А", "Б". Раствор "А". Из набора берут флакон с компонентом 5.2. (натрий фосфорнокислый двузамешенный), содержимое которого вносят в мерную колбу вместимостью 100 см3 1000 холодильник растворяют физиологическим раствором. Для быстрого растворения навески соли - содержимого мерной колбы - рекомендуется подогреть 1000 холодильник обьем довести до метки физиологическим раствором. Раствор "Б", готовят путем растворения содержимого флакона - компонента 5, 3. (калий фосфорнокислый однозамешенный) в физиологическом растворе 1000 холодильник доводят до 100 см3 в мерной колбе. Для приготовления о,01 М фосфатно-буферного раствора с 0,15 М хлоридом натрия ph 7,2-7,4 (ФБР) проводят смешивание растворов "А" 1000 холодильник "Б" в мерной колбе объемом 1000 см3 в следующих соотношениях: раствор "А" - 85,0 см3 раствор "Б" - 28,0 см3 1000 холодильник доводят до метки заранее приготовленным 0,15 М раствором хлорида натрия, затем замеряют значение рН, которое должно быть в пределах 7,2-7,4. Если ph ниже указанного уровня, добавляют необходимое количество раствора "А", если выше - раствора "Б". После приготовления ФБР ph 7,2-7,4 в этот раствор вносят содержимое пробирки - компонент 6 (твин-20), получая конечную концентрацию детергента 0,05%. Данный раствор используют для разведения положительной, отрицательной, исследуемых проб сыворотки крови кур, антивидового конъюгата, промывки лунок планшета. Хранят не более 20 суток в бытовом холодильнике (температура не выше 4° С). 3.4. Раствор n2 - содержимое ампулы - компонент 1 (положительная сыворотка крови кур) растворяют в 2,0 см3 раствора n1, получают разведение положительной сыворотки 1:200. Готовят перед использованием. Допускается хранение в морозильной камере бытового холодильника до 15 суток. 3.5. Раствор n3 - содержимое ампулы - компонент 2 (отри- цательная сыворотка крови кур) растворяют в 2,0 см3 раствора n1, получают разведение отрицательной сыворотки 1:200. Готовят перед использованием. Допускается хранение в морозильной камере бытового холодильника до 15 суток. 3.6. раствор n4 - содержимое ампулы - компонент 4 (анти- видовой конъюгат) растворяют в 21 см 3 раствора n 1. Готовят перед использованием. Допускается хранение в морозильной камере бытового холодильника до 15 суток, 3.7. Раствор n5 - таблетку гидроперита (компонент 8) растворяют в 15 см3 дистиллированной воды, раствор хранят в защищенном от света месте при 4-8 c не более 15 суток. 3.8. Раствор n6 субстратно-индикаторная смесь, содержимое флакона - компонент 7 (5-аминосалициловая кислота) растворя- ют в колбе в 21 см3 подогретой до 50-60 С дистиллированной воды, перемешивают до полного растворения 1000 холодильник просветления раствора 1000 холодильник охлаждают до комнатной температуры (18-20 С). Затем доводят ph до 6,0+0,2 c помощью 1%-ного раствора гидроокиси натрия 1000 холодильник в содержимое колбы добавляют 0,1 см3 раствора n5 (гидроперит). Готовят непосредственно перед использованием, не хранят. 4. ПРОВЕДЕНИЕ ИММНУНОФЕРМЕНТНОГО АНАЛИЗА 4.1. Из комплекта набора берут планшет (компонент 3), в лунках которого адсорбирован очищенный антиген вируса инфекцион- ного бронхита кур 1000 холодильник используют для постановки иммуноферментного анализа. 4.2. Разведение испытуемых сывороток. Образцы исследуемых проб сывороток крови разводят раствором n1. С этой целью к 2,0 см3 указанного раствора добавляют 0,01 см3 сыворотки крови кур, перемешивают 1000 холодильник получают разведение 1:200. 4.3. В три лунки планшета вертикального ряда А1, b1, c1 вносят по 0,1 см3 положительной сыворотки крови (положительный контроль), 1000 холодильник в три следующие лунки d1, Е1, f1 вносят по 0,1 см3 отрицательной сыворотки крови (отрицательный контроль); лунки g1, h1 служат для контроля раствора конъюгата и субстратно-индикаторной смеси (фоновый контроль), в которые вносят по 0,1 см3 раствора n 1. 4.4. В остальные лунки планшета рядов В2-В12...Н2-h12 вносят по 0,1 см3 раствора n1, 1000 холодильник в лунки горизонтального ряда А2-А12 - по 0,2 см3 исследуемых проб сыворотки крови, подготовленных по п.4.2. 1000 холодильник проводят раститровку по вертикальным рядам, начиная от разведения 1:200 до 1:25600. С этой целью из лунок А2-А12 отбирают по 0,1 смЗ разведенных исследуемых сывороток крови 1000 холодильник переносят в лунки В2-В12 соответствующего ряда, пипетируют 1000 холодильник проводят двукратные последовательные разведения переносом по 0,1 см3 в очередную лунку вертикального ряда, удаляя из последних лунок Н2-Н12 по о, 1 см3. 4.5. Планшет осторожно встряхивают для перемешивания содержимого, закрывают крышкой 1000 холодильник переносят в термостат (37,0+0,5С) на 30 мин. Затем лунки планшета освобождают от содержимого путем вытряхивания, трехкратно промывают (по 3 мин) раствором n1 1000 холодильник подсушивают (путем постукивания планшетом по фильтровальной бумаге). 4.6. Готовят раствор n4 по п.3.6. 1000 холодильник вносят во все лунки планшета по 0,1 см3, затем помещают в термостат на 30 мин. После этого содержимое удаляют, лунки трехкратно промывают, удаляют содержимое 1000 холодильник подсушивают путем постукивания перевернутым планшетом по фильтровальной бумаге. 4.7. Готовят раствор n6 по п.3.6. во все лунки планшета вносят по о,1 см3 раствора n6 - субстратно-индикаторную смесь и оставляют при комнатной температуре в темном месте на 10-15 мин. 4.8. Выявление специфических антител можно проводить 1000 холодильник без раститровки испытуемых сывороток, в этом случае вначале проводят раститровку контрольных образцов сывороток: положительной и отрицательной. Предварительно в лунки планшета от В11 1000 холодильник В12 до Н11 1000 холодильник Н12 вносят по 0,1 см3 раствора n1, 1000 холодильник затем в лунки a11 1000 холодильник a12 вносят по 0,2 см3 соответственно положительной 1000 холодильник отрицательной сывороток в разведения 1:200 1000 холодильник проводят двукратную раститровку контрольных сывороток из набора по вертикальным рядам от 1:200 до 1:25600, удаляя из последних лунок по 0,1 см3 содержимого. Для визуального 1000 холодильник спектрофотометрического учета результатов реакции образцы исследуемых (испытуемых) проб сывороток крови берут в разведении 1:200 1000 холодильник вносят по 0,1 см3 в свободные лунки планшета, используя по одной лунке на каждую пробу. Остальные этапы постановки анализа проводят аналогично п.п.4.6., 4.7., 4.8. 4.9. При спектрофотометрическом учете результатов анализа во все лунки планшета для остановки реакции необходимо внести по 0,05 см3 "стоп-реагента", представляющего собой 0,5 М раствор серной кислоты (2 см3 h2 so4 + 18,0 см3 дистиллированной воды). 5. УЧЕТ РЕЗУЛЬТАТОВ РЕАКЦИИ 5.1. Учет результатов анализа проводят через 10-15 мин одним из способов: визуально - по интенсивности окрашивания содержимого лунок планшета или инструментально - с помощью спектрофотометра с вертикальным лучом света путем измерения оптической плотности при длине волны 450 нм. 5.2. При визуальной оценке результатов первоначально проводят учет реакции по контрольным лункам планшета: в лунках с положительной сывороткой (ряд А11...Н11; лунки А1, В1, С1) окрашивание должно быть от желтоватого до темно-коричневого цвета. С разведением положительной сыворотки интенсивность окрашивания уменьшается. Окрашивание содержимого с отрицательной сывороткой 1000 холодильник без сыворотки (фоновый контроль) должно отсутствовать или содержимое может иметь незначительную желтоватую окраску (ряд А12...Н12; лунки d1, Е1, f1, g1, h1). Реакция учитывается при правильных показаниях контролей. Это дает основание считать, что компоненты набора соответствуют требованиям ТУ, 1000 холодильник можно приступить к учету реакции с пробами испытуемых сывороток. 5.3. Визуальный учет результатов основан на сравнении интенсивности цветной окраски содержимого лунок планшета испытуемых проб сывороток крови с окраской лунок контрольного положительного образца (вертикальный ряд А11...h11). Интенсивность цветной реакции прямопропорциональна количеству антител в исследуемых пробах сыворотки крови. Чем выше интенсивность окраски содержимого лунок (от желтоватого до темно-коричневого), тем выше титр антител в исследуемых пробах. 5.4. При постановке реакции без раститровки испытуемых проб титр сыворотки определяют по интенсивности окрашивания испытуемых сывороток в сравнении с интенсивностью окрашивания различных разведений положительной контрольной сыворотки (ряд А11...Н11), которая является как бы эталонной шкалой для оценки результатов. В случае необходимости точного определения титра сыворотки ее раститровывают как указано в п.4.4. 5.5. Раститровка проб испытуемых сывороток крови дает возможность количественно оценивать титр специфических антител. За титр испытуемой сыворотки крови принимают ее последнее разведение, при котором наблюдают видимое глазом цветное окрашивание содержимого лунок, более интенсивное по сравнению с окрашиванием сывороток отрицательного контроля. Положительными считаются пробы сывороток, имеющие окраску разной степени интенсивности, содержимое лунок которых сравнимо с окраской положительной контрольной сыворотки (лунки планшета А11...Н11). Отрицательными считаются пробы сывороток, не изменивших окраску или имеющих незначительное желтоватое окрашивание содержимого лунок, сравнимое с окрашиванием отрицательной контрольной сыворотки (лунки планшета А12...Н12). 5.6. Инструментальный - спектрофотометрический учет результатов анализа позволяет количественно оценить титры специфических антител в исследуемых пробах путем измерений оптической плотности (ОП) при длине волны 450 нм с одновременной записью результатов с каждой лунки планшета на листе бумаги или специальной бумажной ленте. 5.7. При спектрофотометрическом учете результаты оптической плотности выражают в оптических единицах. О результатах реакции судят по коэффициенту соотношений между показаниями оптических плотностей исследуемых проб сывороток 1000 холодильник таковым контрольного образца. Для положительной реакции коэффициент соотношений должен превышать более чем в 2,1 раза оптическую плотность отрицательного контроля что свидетельствует о выявлении специфических антител к вирусу ИБК в исследуемой пробе. Для отрицательной реакции коэффициент соотношений между показаниями оптических плотностей должен быть меньше 2,0, что свидетельствует об отсутствии специфических антител в исследуемой пробе сыворотки. Если коэффициент соотношений оптических плотностей равен 2,0, то реакция оценивается как сомнительная, 1000 холодильник испытуемая проба сыворотки крови подлежит повторному исследованию 1000 холодильник при подтверждении первоначального результата считается положительной. 6. ОЦЕНКА РЕЗУЛЬТАТОВ РЕАКЦИИ 6.1. Обнаружение специфических антител в исследуемых пробах сывороток в титре от 1:200 1000 холодильник выше у 50 1000 холодильник более процентов птицепоголовья, где не проводится специфическая профилактика против ИБК, является диагностически положительным титром и свидетельствует о неблагополучии 1000 холодильник персистенции полевого вируса ИБК в птицехозяйстве. В этом случае положительные сыворотки раститровывают 1000 холодильник при выявлении титров антител 1:800 1000 холодильник выше проводят выделение вируса ИБК 1000 холодильник постановку биопробы. 6.2. При исследовании "парных" проб сывороток крови и обнаружении нарастания титра специфических антител в четыре и более раз не менее, чем у 50% исследуемых проб дает основание для постаноки диагноза на инфекционный бронхит кур. Обнаружение нарастания титра антител в исследуемых пробах, не достигающего четырехкратного увеличения, или выявление нарастания титра менее, чем в 50% испытуемых проб сывороток крови, служат основанием для проведения дополнительных вирусологических исследований. 6.3. При использовании набора для контроля напряженности поствакцинального иммунитета исследуют сыворотки крови через з-4 недели после применения вакцины. При этом уровень поствакцинальных антител должен быть не ниже 1:400 более чем в 80% исследуемых проб сывороток. Методические указания разработаны ведущим научным сотрудни- ком отдела вирусологии ВНИВИП, кандидатом ветеринарных наук, от- ветственным разработчиком Сергеевым В.Д. разделы жила кострома вымпел заказ время кострома купить электрооткрывалку купить пк газонокосилка elmos концепция совершенствование сбыта монетница зиплок icq купить дюпон краска залог кострома масло форма охота гончий thuraya sg 2510 центр консультирование лидо пекарня мини пекарня электрокамин dimplex model magic (sp8) тонировка стекол персонализация карта фирменый цвет зеркало вагинальный аэрография soflens comfort ванна моечный органический растворитель 5440.11 (крышка) красный площадь мавзолей покупка кострома рассылка адрес анимация 3d график вал редуктор поворот утюг de luxe 5040.11 зубной протез французский вина маска косметический зиплок пломбирование фейрверк вечеринка 1000 холодильник